PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)的簡稱。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)也可以當(dāng)作一項(xiàng)極其重要的酶促合成DNA技術(shù)。PCR又稱為無細(xì)胞克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新，它可將極微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍。

 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。

 一對合成DNA的引物經(jīng)過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。

二、設(shè)計(jì)要點(diǎn)

1、主體結(jié)構(gòu)：

 目前實(shí)驗(yàn)室的主體多為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽角均采用鋁合金R50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。并且彩鋼板結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。

2、標(biāo)準(zhǔn)的四區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：

 將PCR過程分成試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備和PCR擴(kuò)增區(qū)及產(chǎn)物分析檢測區(qū)四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個(gè)區(qū)域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時(shí)各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。

3、消毒：

 在四個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)和四個(gè)緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū)還設(shè)置移動(dòng)紫外線燈，對實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。

4、機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗：

 試劑和標(biāo)本通過機(jī)械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。

5、地面

 地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。

6、照明

 燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。另外：

?PCR實(shí)驗(yàn)室可分為兩個(gè)大的功能工作區(qū)域：核酸擴(kuò)增前區(qū)和核酸擴(kuò)增后區(qū)。核算擴(kuò)增前區(qū)包括試劑準(zhǔn)備間和樣本制備間，這個(gè)兩房間各自獨(dú)立，不能出現(xiàn)空氣互通，這兩個(gè)房間相對外界氣壓呈正壓狀態(tài)。核酸擴(kuò)增后區(qū)包括擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)，使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀、HIV病毒載量測定儀的PCR實(shí)驗(yàn)室，這個(gè)兩區(qū)域可以合并為一個(gè)房間。這個(gè)區(qū)域如果是分開兩個(gè)房間，這兩個(gè)房間也必須是各自獨(dú)立，不能出現(xiàn)空氣互通。核算擴(kuò)增后區(qū)對外界氣壓呈負(fù)壓狀態(tài)。

 PCR實(shí)驗(yàn)室根據(jù)使用儀器的功能合理設(shè)置各個(gè)工作區(qū)域，如采用聚合酶聯(lián)反應(yīng)：則設(shè)置試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域，這是最常用的分區(qū)方式。樣品需要粉碎處理的，還需增設(shè)樣品粉碎區(qū)；若使用實(shí)時(shí)熒光PCR法：基因擴(kuò)增區(qū)、基因產(chǎn)物分析區(qū)可以合并在一個(gè)房間內(nèi)；采用標(biāo)本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測為一體的全自動(dòng)化PCR分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并為一個(gè)區(qū)域，因此PCR實(shí)驗(yàn)室原則上設(shè)置五個(gè)區(qū)或四個(gè)區(qū)或三個(gè)區(qū)或二個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)。

 核酸擴(kuò)增前區(qū)和核酸擴(kuò)增后區(qū)可設(shè)在一個(gè)房間內(nèi)，但必須在滿足下列要求的前提下：

a.核酸擴(kuò)增前區(qū)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)設(shè)置兩個(gè)不同位置的實(shí)驗(yàn)區(qū)，試劑配置在超凈工作臺(tái)中操作，樣品處理在生物安全柜內(nèi)操作。

b.在核酸擴(kuò)增后區(qū)使用全封閉的擴(kuò)增和檢測系統(tǒng)，如實(shí)時(shí)熒光PCR儀等。

c.每個(gè)實(shí)驗(yàn)人員使用各自的試劑、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。

d.在實(shí)驗(yàn)前后對操作區(qū)域和共享器具進(jìn)行清潔及消毒。

e.各區(qū)域的試劑、器具、儀器和設(shè)備為該區(qū)專用，不得交叉使用。

三、空氣流與壓差要求

 PCR實(shí)驗(yàn)室的空氣流向必須嚴(yán)格按照試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)空氣壓力逐漸遞減方式進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域。風(fēng)速流向不得混亂。

 為了保證房間內(nèi)的壓差和避免污染，應(yīng)在空調(diào)面板處寫清楚送風(fēng)機(jī)和排風(fēng)機(jī)的開啟順序和關(guān)閉順序，先后順序不得混亂。

 空氣潔凈級(jí)別不同的相鄰房間之間的靜壓差應(yīng)大于5帕，潔凈室(區(qū))與室外大氣的靜壓差應(yīng)大于10帕，應(yīng)配備監(jiān)測靜壓差的設(shè)備，并定期監(jiān)控。

 一般情況下，試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染；可以通過控制進(jìn)風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達(dá)到正壓效果。

 核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓，以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散出去污染試劑與樣品，可以通過控制排風(fēng)風(fēng)量大于進(jìn)風(fēng)風(fēng)量達(dá)到負(fù)壓效果。

 在理想情況下，PCR實(shí)驗(yàn)室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)風(fēng)由原有中央空調(diào)控制的要求將中央空調(diào)風(fēng)口安裝到指定定點(diǎn)。

四、實(shí)驗(yàn)室面積及設(shè)備間距

 一般來說各房間的面積沒有嚴(yán)格要求，只需能放置所需儀器設(shè)備，并且便于人員操作即可，但是有生物安全柜的房間面積不能小于10平米，并且每增加一臺(tái)生物安全柜，房間就要增加10平米。

 各實(shí)驗(yàn)室緩沖間的面積一般為1300*（1300或1500）mm為宜，并且緩沖間的面積不能大于實(shí)驗(yàn)室房間面積的1/8。

 在做平面設(shè)計(jì)的時(shí)候，首先要考慮的因素是就是“安全”，實(shí)驗(yàn)室是最易發(fā)生爆炸、火災(zāi)、毒氣泄露等的場所。我們在做平面設(shè)計(jì)的時(shí)候，應(yīng)盡量地要保持實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)流暢、逃生通道暢通。根據(jù)國際人體工程學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。我們做如下的劃分以供參照：實(shí)驗(yàn)臺(tái)與實(shí)驗(yàn)臺(tái)通道劃分標(biāo)準(zhǔn)(通道間隔用L表示)L>500mm時(shí)，一邊可站人操作；L>800mm時(shí)，一邊可坐人操作；

L>1200mm時(shí)，一邊可坐人，一邊可站人，中間不可過人;

L>1500mm時(shí)，兩邊可坐人，中間可過人；

L>1800mm時(shí)，兩邊可坐人，中間可過人可過儀器

 天平臺(tái)、儀器臺(tái)不宜離墻太近，離墻400mm為宜。為了在工作發(fā)生危險(xiǎn)時(shí)易于疏散，實(shí)驗(yàn)臺(tái)間的過道應(yīng)全部通向走廊。另:實(shí)驗(yàn)室建筑層高宜為3.7米-4.0米為宜，凈高宜為2.7米-2.8米，有潔凈度、壓力梯度、恒溫恒濕等特殊要求的實(shí)驗(yàn)室凈高宜為2.5米-2.7米（不包括吊頂）；實(shí)驗(yàn)室走廊凈寬宜為2.5米-3.0米.普通實(shí)驗(yàn)室雙門寬以1.1米-1.5米(不對稱對開門)為宜,單門寬以0.8米-0.9米為宜。

五、潔凈裝修要求

 潔凈室（區(qū)）的內(nèi)表面應(yīng)平整光滑、無裂縫、接口嚴(yán)密、無顆粒物脫落，并能耐受清洗和消毒，墻壁與地面的交界處宜成弧形或采取其他措施，以減少灰塵積聚和便于清潔。

 潔凈室(區(qū))內(nèi)各種管道、燈具、風(fēng)口以及其他公用設(shè)施，在設(shè)計(jì)和安裝時(shí)應(yīng)考慮使用中避免出現(xiàn)不易清潔的部位。

 潔凈室(區(qū))的窗戶、天棚及進(jìn)入室內(nèi)的管道、風(fēng)口、燈具與墻壁或天棚的連接部位均應(yīng)密封。

六、工作服要求

 在凈化車間內(nèi)工作的人員應(yīng)穿著符合要求的工作服。工作服的選材、式樣及穿戴方式應(yīng)與生產(chǎn)操作和空氣潔凈度級(jí)別要求相適應(yīng)，并不得混用。潔凈工作服的質(zhì)地應(yīng)光滑、不產(chǎn)生靜電、不脫落纖維和顆粒性物質(zhì)。無菌工作服必須包蓋全部毛發(fā)、胡須及腳部，并能阻留人體脫落物。不同空氣潔凈度級(jí)別使用的工作服應(yīng)當(dāng)分別清洗、整理，必要時(shí)消毒或滅菌。工作服洗滌、滅菌時(shí)不應(yīng)帶入附加的顆粒物質(zhì)。工作服應(yīng)制定清洗周期。

 進(jìn)入各個(gè)區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開時(shí)，不得將工作服帶出。

 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立、執(zhí)行人員進(jìn)出潔凈區(qū)的清潔程序和管理制度，人員清潔程序合理。

七、人流路徑與物流路徑

 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室區(qū)域工作人員應(yīng)該按照以下路徑：

 公共清潔區(qū)——更衣間（更換潔凈服）——緩沖間——污染實(shí)驗(yàn)區(qū)

 工作人員退出實(shí)驗(yàn)室的路徑為：

 污染試驗(yàn)區(qū)——緩沖間——淋浴間（有條件的可設(shè)置）——更衣間——公共清潔區(qū)所有的物品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)必須經(jīng)過雙扉互鎖傳遞窗，利用傳遞窗消毒后才可進(jìn)入，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有物品的也必須經(jīng)過傳遞窗才可以傳遞到實(shí)驗(yàn)室以外的清潔公共區(qū)。

八、門的開啟方向

 實(shí)驗(yàn)室建筑層高宜為3.7米-4.0米為宜，PCR實(shí)驗(yàn)室凈高宜為2.5米-2.7米（不包括吊頂）；實(shí)驗(yàn)室走廊凈寬宜為2.5米-3.0米.普通實(shí)驗(yàn)室雙門寬以1.1米-1.5米(不對稱對開門)為宜,單門寬以0.8米-0.9米為宜。

 一般實(shí)驗(yàn)室門主要向里開，但如有危險(xiǎn)的房間，房門應(yīng)朝外開，房門材質(zhì)最好選擇壓力玻璃。

 有壓差梯度的房間，門的開啟方向應(yīng)朝向正壓方向一側(cè)開啟；

 考慮到消防安全，對于那些主要逃生門的開啟方向應(yīng)朝向清潔區(qū)方向開啟。

九、基本儀器設(shè)備考慮

(1)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

 該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)應(yīng)對外界保持微正壓。

 試劑準(zhǔn)備區(qū)儀器設(shè)備主要應(yīng)有加樣器、冰箱、天平、低速離心機(jī)、混勻器、可移動(dòng)紫外燈等。可使用超凈工作臺(tái)作為試劑配制操作臺(tái)面。

(2)標(biāo)本制備區(qū)

 該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定DNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。

 標(biāo)本制備區(qū)儀器設(shè)備主要應(yīng)有生物安全柜（最好為B2，可避免提取核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標(biāo)本間交叉“污染”，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。此外還應(yīng)配備加樣器、臺(tái)式高速離心機(jī)（冷凍及常溫）、臺(tái)式低速離心機(jī)、恒溫設(shè)備（水浴和/或干浴儀）、冰箱、混勻器和可移動(dòng)紫外燈等。

(3)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

 該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA擴(kuò)增和擴(kuò)增片段的測定。此外，已制備的DNA模板(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

 擴(kuò)增區(qū)主要儀器就是核酸擴(kuò)增熱循環(huán)儀（PCR儀，實(shí)時(shí)熒光或普通的）。熱循環(huán)儀的電源應(yīng)專用，并配備一個(gè)穩(wěn)壓電源或UPS，以防止由于電壓的波動(dòng)對擴(kuò)增測定的影響。此外，根據(jù)工作需要，還可配備加樣器、超凈臺(tái)等。

 產(chǎn)物分析區(qū)：本區(qū)所使用的儀器設(shè)備可能有加樣器、電泳儀（槽）、電轉(zhuǎn)印儀、雜交爐或雜交箱、水浴箱、DNA測序儀、酶標(biāo)儀和洗板機(jī)等。

十、實(shí)驗(yàn)室風(fēng)量測算

1、排風(fēng)量的計(jì)算方法：

 根據(jù)面風(fēng)速來確定排風(fēng)量（面風(fēng)速的一般取值為：0.3~0.5m3/h）計(jì)算公式：

G=S•V•h•μ=L•H•3600•μ

十一、安全注意問題

A、生物安全柜的擺放位置不易擺放在與出入口緊鄰的墻體上；

B、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的通訊設(shè)施應(yīng)該放置于生物安全柜對面；

C、實(shí)驗(yàn)室門口位置設(shè)置緊急洗眼器和緊急噴淋，以防止實(shí)驗(yàn)人員受到傷害；

D、高壓滅菌器應(yīng)與傳遞窗緊鄰；

E、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的壓力顯示器和報(bào)警裝置都應(yīng)放置在醒目位置；

F、與室外聯(lián)系的電話應(yīng)放置在醒目位置，并且放置在便于實(shí)驗(yàn)室人員快速拿起的位置；

G、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該具有防止昆蟲和其他動(dòng)物進(jìn)入的措施。

十二、PCR實(shí)驗(yàn)室管理

（1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的門；

（2）盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性；

（3）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；

（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。