HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃

HIV 實(shí) 驗(yàn) 室 規(guī) 劃

人類(lèi)免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)及其相關(guān)標(biāo)志的檢測(cè)是預(yù)防HIV感染和艾滋病臨床治療中重要的環(huán)節(jié)，在艾滋病的防治工作中具有重要作用，如艾滋病的診斷、HIV感染的診斷、血源及器官供體的篩選、流行病學(xué)調(diào)查、艾滋病病人及HIV感染者的病情動(dòng)態(tài)觀(guān)察、臨床治療療效考核以及HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃的安全性和效果鑒定等。

HIV感染標(biāo)志分為病毒標(biāo)志、免疫標(biāo)志和相關(guān)標(biāo)志三大類(lèi)。病毒標(biāo)志是指直接從HIV感染者體內(nèi)分離出病毒或檢出HIV組成成分(抗原或核酸)。免疫標(biāo)志是指HIV感染所產(chǎn)生的HIV抗原、抗體等免疫物質(zhì)。相關(guān)標(biāo)志是指HIV感染后與艾滋病病情進(jìn)展有密切關(guān)系的某些標(biāo)志，如CD4細(xì)胞、CD8細(xì)胞，β2微球蛋白、有關(guān)細(xì)胞因子等。這些標(biāo)志的測(cè)定可為HIV感染及臨床療效的考核提供極為重要的診斷、治療和預(yù)后指征。目前實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃的檢測(cè)是艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中最常用的方法，因?yàn)镠IV抗體是患者感染HIV后最容易檢出并且持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)的免疫學(xué)標(biāo)志，而且抗體的檢測(cè)方法大多簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，易于推廣應(yīng)用。

在介紹各種HIV實(shí)驗(yàn)室診斷方法之前，為了使實(shí)驗(yàn)室工作人員能夠有效地確保結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、優(yōu)質(zhì)，我們必須對(duì)作為一種感染因子的HIV以及由它所導(dǎo)致的致命性危害有基本的認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)特別注意病毒的結(jié)構(gòu)、抗原組成，人體的免疫反應(yīng)，診斷試驗(yàn)的基本原理、試驗(yàn)結(jié)果的解釋?zhuān)约盀榱藴?zhǔn)確而有效地提供實(shí)驗(yàn)診斷所必需的質(zhì)量保證措施。如果由于缺乏技術(shù)專(zhuān)長(zhǎng)或基本知識(shí)而造成不正確的試驗(yàn)結(jié)果是不可原諒的。現(xiàn)將有關(guān)內(nèi)容扼要介紹如下：

一、人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)概述：

（一）艾滋病病原體的發(fā)現(xiàn)和命名：

(二)HIV病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分類(lèi)和分型

HIV病毒是帶有包膜的RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，在分類(lèi)上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科中的慢病毒亞科。目前發(fā)現(xiàn)有HIV-1和HIV-2兩型。現(xiàn)已將HIV-1分為M組，共10個(gè)亞型(A-J)和O組，HIV-2也至少有6個(gè)亞型（A-F）。在我國(guó)流行的是HIV-1，檢測(cè)到的亞型有8種之多，其中B亞型幾乎見(jiàn)于我國(guó)各個(gè)地區(qū)，而C亞型主要見(jiàn)于我國(guó)西南和西北地區(qū)，E亞型則多見(jiàn)于東南沿海和西南邊境地區(qū)。

HIV病毒呈球形或卵圓形顆粒，直徑100-140mm，具有包膜。包膜是在病毒出芽釋放過(guò)程中獲得的。從脂質(zhì)膜上延伸出來(lái)的刺和園頭是糖蛋白(gp)。病毒顆粒內(nèi)部為核心，具有蛋白質(zhì)衣殼，里面有兩個(gè)相同拷貝的核酸(RNA)和病毒的三種酶：逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、整合酶和蛋白酶。

HIV基因組(RNA)含有9個(gè)基因，可分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。結(jié)構(gòu)基因包括gag、pol和env3個(gè)，皆為調(diào)節(jié)基因。

(三)實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃與診斷技術(shù)密切相關(guān)的HIV抗原

由三個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼的HIV-1抗原如下：
1、gag蛋白：位于病毒顆粒內(nèi)核心部位，主要有分子量為55000道爾頓的蛋白質(zhì)(P)，稱(chēng)P55。P55抗原是前體蛋白，在感染過(guò)程的早期產(chǎn)生，爾后裂解成其他核蛋白，包括P24、P17和P15等。

2、env(包膜)糖蛋白：包膜抗原皆為糖蛋白(gp)，根據(jù)分子量分別稱(chēng)為gp160、gp120和gp41。gp160是前體蛋白，是在感染過(guò)程中產(chǎn)生的一種成份，隨后裂解成gp120和gp41。gp120是外膜蛋白，組成外膜的72個(gè)刺突和園頭。gp41為跨膜蛋白。二者共同參與病毒與突主細(xì)胞CD4分子的粘附。

3、pol(聚合酶)蛋白質(zhì)：包括P66(RT)、P51和P31(整合酶或核酸內(nèi)切酶)。
盡管HIV-1和HIV-2抗原之間有交叉，但它們也有各自的特異性抗原。

大多數(shù)交叉反應(yīng)是由抗核心抗原的抗體所致，因?yàn)檫@二種不同病毒的gag抗原是非常保守的。各自的這些特異性抗原在HIV-1和HIV-2是相似的，但分子量可略有不同。例如，HIV-2的跨膜蛋白抗原稱(chēng)為gp36，而某些人則稱(chēng)之為gp41，又如主要的核心抗原為P24，但在HIV-2又稱(chēng)P26。

(四)HIV感染的生物學(xué)和免疫應(yīng)答：
人體能對(duì)HIV的侵入產(chǎn)生抗體應(yīng)答，通常是在HIV感染2-10周內(nèi)機(jī)體產(chǎn)生抗體。但也有極少數(shù)人感染數(shù)月乃至數(shù)年后仍測(cè)不出抗體，故陰性結(jié)果并不說(shuō)明受檢者絕無(wú)感染。絕大多數(shù)人在感染過(guò)程中都會(huì)對(duì)各種病毒抗原成份產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抗體滴度可高達(dá)1：50000，但也可以很低。感染早期（血清陽(yáng)轉(zhuǎn)時(shí)）及病程后期（免疫缺陷）時(shí)，抗體滴度均較低。

大多數(shù)病毒感染者都有IgM抗體產(chǎn)生，但HIV感染者中似乎不完全有IgM應(yīng)答。對(duì)于有IgM抗體應(yīng)答者，在窗口期檢出IgM抗體是有益的。

HIV基因組可整合到宿主細(xì)胞DNA上使機(jī)體終身帶有病毒，但機(jī)體可能很多年不出現(xiàn)癥狀，成為HIV無(wú)癥狀感染者，只是查血時(shí)發(fā)現(xiàn)抗—HIV陽(yáng)性。爾后，在某些因素作用下，病毒被激活后并開(kāi)始大量復(fù)制出現(xiàn)癥狀和各種合并癥，則發(fā)展成艾滋病病人，HIV病毒很容易發(fā)生變異這是研制有效疫苗的主要困難之一。

二、HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃

人體感染HIV后，血液中最先出現(xiàn)HIV抗原，然后很快消失直到疾病后期才重新出現(xiàn)。幾周后出現(xiàn)IgM抗體并很快消失，此后,IgG抗體出現(xiàn)并一直存在。因此，HIV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷以抗體檢測(cè)為主，病毒及相關(guān)抗原的檢測(cè)為輔。

抗體檢測(cè)分為初篩試驗(yàn)和確證試驗(yàn)兩種，初篩試驗(yàn)為陽(yáng)性的血清必須進(jìn)一步確證，確證為陽(yáng)性的方可報(bào)告為HIV感染陽(yáng)性。

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)主要用于檢測(cè)血漿中HIV的RNA含量，目前主要用于預(yù)測(cè)母親將HIV傳染給胎兒的可能性以及新生兒的HIV感染狀況。此外，尚可用于判斷病人的預(yù)后及監(jiān)測(cè)抗病毒治療的效果。

（一）標(biāo)本收集
HIV感染者血清標(biāo)本的收集按常規(guī)方法進(jìn)行，靜脈抽血，不加抗凝劑。標(biāo)本在室溫或4℃冰箱靜置24小時(shí)，待血清析出后作抗體檢測(cè)。污染標(biāo)本可短時(shí)間離心后取上清液作檢測(cè)，但解釋結(jié)果時(shí)應(yīng)慎重。
用于檢測(cè)HIV抗原的血液樣本與檢測(cè)抗體的樣本的處理有所不同，根據(jù)需要，血液樣本需進(jìn)行核酸處理。采用定量PCR方法檢測(cè)病毒含量時(shí)，加入肝素的血漿，檢測(cè)的RNA含量較未加肝素的血漿樣本高。

檢驗(yàn)人員應(yīng)注意自身的防護(hù)，在未證實(shí)之前，所有的標(biāo)本均應(yīng)當(dāng)作“陽(yáng)性”標(biāo)本看待。

（二）HIV抗體的初篩檢測(cè)

初篩試驗(yàn)的要求是敏感性高，理論上要求達(dá)到100%，盡可能避免漏掉可能陽(yáng)性的對(duì)象，相對(duì)來(lái)說(shuō)，對(duì)特異性要求不是太嚴(yán)，允許有少量假陽(yáng)性，這些假陽(yáng)性可以通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)和確證試驗(yàn)排除。

HIV抗體初篩檢測(cè)的方法很多，如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)、明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)(gelatineparticleagglutinationassay,PA)、乳膠凝集實(shí)驗(yàn)(latexagglutinationassay,LA)、各種快速檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(rapidtests)、放射免疫實(shí)驗(yàn)(radioimmunoassay)等。這些實(shí)驗(yàn)使用的抗原早期是完整病毒的裂解產(chǎn)物，稱(chēng)為第一代試劑，這種抗原常常由于含有宿主細(xì)胞的成分而出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，為了獲得可接受的特異性而稀釋標(biāo)本使試劑的敏感性也有所下降，同時(shí)這種抗原制備和純化都比較困難，危險(xiǎn)性大。第二代試劑使用重組或合成多肽HIV抗原，選擇與免疫反應(yīng)相關(guān)的抗原決定簇，敏感性和特異性均有所提高，這類(lèi)抗原制備也更為安全、容易、重復(fù)性好。應(yīng)該注意的是重組抗原有時(shí)由于含有載體的組分而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，多肽抗原由于缺乏合適的立體構(gòu)象有可能使敏感性下降從而導(dǎo)致假陰性。使用重組或合成多肽抗原制備的雙抗原夾心法試劑盒常常被稱(chēng)為第三代試劑，這種試劑可以檢測(cè)針對(duì)HIV抗原的所有抗體亞類(lèi)，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD，同時(shí)不需要將標(biāo)本過(guò)度稀釋來(lái)保證特異性，因而具有較高的敏感性。第四代試劑除使用重組或合成多肽抗原外還包被了P24抗體，可同時(shí)檢測(cè)抗原和抗體。

1．酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）是最常見(jiàn)的HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃抗體檢測(cè)方法，它具有準(zhǔn)確性高、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果有客觀(guān)標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批量標(biāo)本的檢測(cè)，是獻(xiàn)血員篩選和臨床診斷最常用的方法。

（1）方法和原理：使用最多的ELISA方法是間接法，這種方法的原理是將HIV抗原包被到微孔板或其他固相載體上，如標(biāo)本中含有HIV抗體，則抗體就會(huì)和固相載體上的HIV抗原結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合的非特異性抗體，加入酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體與HIV抗體結(jié)合，形成HIV抗原－HIV抗體－酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體復(fù)合物，最后加入底物發(fā)生酶催化的顯色反應(yīng)，測(cè)定光密度值(opticaldensity,OD)，與判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，就可以得出標(biāo)本中HIV抗體是陽(yáng)性或陰性的結(jié)果了。間接法使用的標(biāo)記抗體通常是抗人IgG，為了提高敏感性有時(shí)也加入抗人IgM。這種方法的特異性由包被于固相載體上的HIV抗原決定，相對(duì)來(lái)說(shuō)特異性不高，存在非特異性問(wèn)題。

另一種常用的ELISA方法是雙抗原夾心法，將HIV抗原包被到固相載體上，標(biāo)本中的HIV抗體與抗原結(jié)合形成復(fù)合物，由于抗體的雙價(jià)或多價(jià)性，它同時(shí)還能與其他抗原結(jié)合，加入酶標(biāo)記的同一類(lèi)HIV抗原分子時(shí)，后者就會(huì)與固相載體上的抗體結(jié)合，形成HIV抗原－HIV抗體－酶標(biāo)記HIV抗原復(fù)合物，最后加入底物發(fā)生酶催化的顯色反應(yīng)，測(cè)定光密度值，與判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，就可以得知標(biāo)本中HIV抗體是陽(yáng)性還是陰性。

還有一種ELISA方法是競(jìng)爭(zhēng)法。它的主要特點(diǎn)是酶標(biāo)記抗體是特異性的HIV抗體。標(biāo)本中的HIV抗體與酶標(biāo)記HIV抗體競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的HIV抗原，操作時(shí)同時(shí)加入標(biāo)本和酶標(biāo)記HIV抗體，如標(biāo)本中的抗體濃度高，酶標(biāo)記HIV抗體就不能與固相載體上的HIV抗原結(jié)合或結(jié)合得很少，顯色反應(yīng)就較弱，相反，如標(biāo)本中的HIV抗體含量很少或沒(méi)有，大量的酶標(biāo)記HIV抗體將與固相載體上的HIV抗原結(jié)合，顯色反應(yīng)就很強(qiáng)。因而在競(jìng)爭(zhēng)法中，光密度值與標(biāo)本中的抗體含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這種方法是將標(biāo)本與酶標(biāo)抗體同時(shí)加入，需時(shí)更短，另外這種方法具有較好的特異性。

（2）結(jié)果的判斷：ELISA方法是根據(jù)臨界值(cutoffvalue,CO)判斷結(jié)果的。臨界值是將檢測(cè)的陽(yáng)性和（或）陰性對(duì)照的OD值代入廠(chǎng)商提供的計(jì)算公式計(jì)算出來(lái)的判斷陽(yáng)性和性結(jié)果的界值。對(duì)于間接法和雙抗原夾心法，標(biāo)本OD值與臨界值的比值大于等于1（S／CO≥1）為陽(yáng)性；對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)法，標(biāo)本OD值與臨界值的比值小于等于1（S／CO≤1）為陽(yáng)性。
2．從尿液中測(cè)抗體
尿液艾滋病病毒（HIV－1）抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒（CalypteTMHIV-1尿液EIA）是酶免疫測(cè)定方法在體外檢測(cè)尿液中HIV－1抗體。此法用于實(shí)驗(yàn)室輔助臨床HIV感染診斷。在確定標(biāo)本HIV－1抗體的結(jié)果之前，根據(jù)美國(guó)疾病控制中心推薦的HIV抗體的診斷步驟，此項(xiàng)檢測(cè)重復(fù)陽(yáng)性的標(biāo)本，用卡里普特公司的劍橋生物HIV－1尿液WesternBlot試劑盒進(jìn)行確診。
近年與血液檢查相比，尿液檢查有多種優(yōu)點(diǎn)。在尿液中一般不存在HIV病毒。卡里普特公司的劍橋生物HIV－1尿液WesternBlot試劑盒，可對(duì)于尿液EIA重復(fù)陽(yáng)性標(biāo)本做確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。
尿液艾滋病病毒（HIV－1）抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒（calypteTMHIV-1尿液EIA）是利用重組的HIV－1表面抗原在尿液中檢測(cè)HIV－1抗體。微孔板的孔中包被gp160膜抗原。把尿液標(biāo)本或?qū)φ张c標(biāo)本緩沖液一起加入孔中溫育。如果標(biāo)本中存在HIV－1膜抗原的抗體，它們將與孔中的抗原結(jié)合。標(biāo)本緩沖液用來(lái)減低孔中其它蛋白及抗體對(duì)孔壁的非特異性結(jié)合。通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)。然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白抗體并溫育。酶聯(lián)物與孔中結(jié)合到抗原的HIV－1抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的酶聯(lián)物，然后加入底物（p-NPP）。如標(biāo)本中含有HIV－1抗體，酶將使孔內(nèi)液體由無(wú)色變?yōu)辄S色，顏色的強(qiáng)度與標(biāo)本中抗體含量成正比。反應(yīng)用EDTA終止，用酶標(biāo)儀在405nm處測(cè)吸收峰而讀取結(jié)果。
試劑盒中包括陽(yáng)性及陰性對(duì)照，每板應(yīng)做2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照及3個(gè)陰性對(duì)照，將陰性對(duì)照平均吸收值加0.18得到cutoff值，標(biāo)本是通過(guò)與Cutoff值比較來(lái)判斷是否為陽(yáng)性或陰性。
第一次檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本應(yīng)用同一標(biāo)本再重復(fù)檢測(cè)，如果重復(fù)檢測(cè)仍為陽(yáng)性，標(biāo)本為重復(fù)陽(yáng)性標(biāo)本。重復(fù)陽(yáng)性標(biāo)本用卡里普特公司的劍橋生物HIV－1WesterBlot試劑盒進(jìn)一步確認(rèn)。
3．膠體金法檢測(cè)HIV1/2抗體實(shí)驗(yàn)
膠體金法檢測(cè)HIV抗體是一種不需要任何儀器設(shè)備的血清／血漿檢測(cè)法，它利用免疫層析分析原理來(lái)快速檢測(cè)血清／血漿中是否含有HIV抗體，從而用于判斷人體是否受到HIV1型／HIV2型病毒感染。
（1）方法和原理
試劑盒采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)來(lái)定性檢測(cè)血清／血漿中是否含有HIV抗體，試劑盒含有被事先固定于膜上測(cè)試區(qū)（T）的重組HIV抗原和質(zhì)控區(qū)（C）的抗-proteinA抗體。
測(cè)試時(shí)，血標(biāo)本滴入試劑盒加樣孔（S）內(nèi)，血標(biāo)本中的HIV抗體與預(yù)包被在膜上的proteinA膠體金結(jié)合物反應(yīng)。然后，混合物隨之在毛細(xì)管向上層析，在測(cè)試區(qū)（T）與固定在膜上的重組HIV抗原反應(yīng)。如果血清中含有HIV－1抗體或HIV－2抗體，在測(cè)試區(qū)內(nèi)（T）會(huì)出現(xiàn)一條紅色條帶，表明是陽(yáng)性結(jié)果。如果在測(cè)試區(qū)內(nèi)（T）沒(méi)有出現(xiàn)紅色條帶，則血清中不含有HIV抗體，表明是陰性結(jié)果。無(wú)論HIV抗體是否存在于血清中，混合物都會(huì)繼續(xù)向上層析至質(zhì)控區(qū)（C），質(zhì)控區(qū)的抗ProteinA與ProteinA膠體金結(jié)合物反應(yīng)出現(xiàn)一條紅色條帶。質(zhì)控區(qū)內(nèi)（C）所顯現(xiàn)的紅色條帶是判定是否有足夠血標(biāo)本，層析過(guò)程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。
（2）結(jié)果判定
陽(yáng)性（＋）：兩條紅色帶出現(xiàn)。一條位于測(cè)試區(qū)內(nèi)（T），另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)（C）。
陰性（－）：僅質(zhì)控區(qū)（C）出現(xiàn)一條紅色條帶，在測(cè)試區(qū)內(nèi)（T）無(wú)紅色條帶出現(xiàn)。
無(wú)效：質(zhì)控區(qū)（C）未出現(xiàn)紅色條帶，表明不正確的操作過(guò)程或試劑盒已變質(zhì)損壞。在任何情況下，應(yīng)重新測(cè)試。如果問(wèn)題仍然存在，應(yīng)立即停止使用此批號(hào)產(chǎn)品，并與當(dāng)?shù)毓?yīng)商聯(lián)系。
注意：由于樣本中HIV抗體滴度的不同，測(cè)試區(qū)（T）內(nèi)的紅色條帶會(huì)顯現(xiàn)出不同深淺的顏色。但是，本試劑盒的測(cè)試結(jié)果不能做為判定樣本中抗體滴度高低的依據(jù)。
4.明膠顆粒凝集試驗(yàn)
明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA)是一種快速的HIV血清抗體的檢測(cè)方法。先將樣品稀釋?zhuān)缓蠹尤氚豢乖拿髂z顆粒，混勻后保溫(一般為室溫)。由于操作方便，且無(wú)需特殊儀器設(shè)備，很適合于對(duì)少量標(biāo)本的檢測(cè)。當(dāng)血清或血漿中有HIV抗體存在時(shí)，經(jīng)HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原—抗體相互作用，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。
(1)操作方法
①待測(cè)血清從1：4開(kāi)始作倍比稀釋。
②1：8血清稀釋孔加25μ1非致敏粒子，1：16血清稀釋孔加25μ1致敏粒子。
③設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照血清，使其終末滴度為1：128。
④振蕩混勻，加好蓋板，室溫(20℃)靜置2小時(shí)觀(guān)察結(jié)果
(2)結(jié)果觀(guān)察
①明膠顆粒沉積在孔底，周邊平滑，或形成致密圓圈為陰性結(jié)果；
②孔底呈現(xiàn)均勻的凝集現(xiàn)象，或形成一個(gè)大的邊緣不整齊的圓圈，為陽(yáng)性結(jié)果。
(3)注意事項(xiàng)
標(biāo)本應(yīng)為新鮮標(biāo)本，無(wú)溶血。若標(biāo)本與致敏粒子、非致敏粒子均出現(xiàn)反應(yīng)，應(yīng)將標(biāo)本先和非致敏粒子吸附，然后再作檢測(cè)。
明膠顆粒凝集試驗(yàn)

孔號(hào)	1	2	3
待檢血清 血清稀釋液 未致敏顆粒 致敏顆粒 稀釋度	1：4	1:16	1:32

(三)、確證（確認(rèn)）試驗(yàn)
確證（確認(rèn)）試驗(yàn)主要用蛋白印跡試驗(yàn)(WesternBlot,WB)。蛋白印跡法是將HIV病毒蛋白用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PolyacrylamideGel)電泳。將分子量大小不等的蛋白帶分離開(kāi)來(lái)，然后再把這些已經(jīng)分離的不同蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。將此膜切割成條狀，每一條硝酸纖維膜上均含有經(jīng)電泳分離過(guò)的HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1：100，再把它直接放到硝酸纖維膜上，并靜置一段時(shí)間，使其充分接觸反應(yīng)，血清中若含有HIV抗體，就會(huì)與硝酸纖維膜條上的抗原帶相結(jié)合。經(jīng)過(guò)沖洗去掉未結(jié)合的多余抗體，并加入抗人－IgG酶結(jié)合物，洗去未結(jié)合的抗人－IgG酶結(jié)合物，加入底物，即可使有反應(yīng)的抗原、抗體結(jié)合條帶呈現(xiàn)紫褐色，這表示陽(yáng)性反應(yīng)。此法一般是在ELISA或其它初篩檢測(cè)陽(yáng)性后再用來(lái)確認(rèn)。
1、結(jié)果判斷
a、膜條沒(méi)有條帶出現(xiàn)表示陰性（一）
b、待檢標(biāo)本出現(xiàn)條帶的色度小于弱陽(yáng)性對(duì)照gp120帶色度時(shí)表示可疑（±）。
c、待檢標(biāo)本出現(xiàn)的條帶色度相當(dāng)于弱陽(yáng)性照gp120帶色度但比強(qiáng)陽(yáng)性條帶的色度弱時(shí)表示（+）。
d、待檢標(biāo)本出現(xiàn)的條帶色度相當(dāng)于或大于強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照gp120帶色度時(shí)表示（++）。
GAGP55，P24，P17
ENVgp160,gp120,gp41
POLp65,p51,p32
(1)以上三個(gè)基因組里各出現(xiàn)任何一條帶，而且其色度在“+”或“±”以上者表示陽(yáng)性。最近，美國(guó)CDC規(guī)定：在P24，gp41,gp120/gp160四條帶中出現(xiàn)任何二條帶者表示陽(yáng)性。
(2)有一個(gè)或多個(gè)條帶但不符合陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)者表示可疑。
(3)未出現(xiàn)任何條帶者表示陰性。
2、注意事項(xiàng)：
a、每次反應(yīng)之間，要充分洗凈。
b、反應(yīng)條件是室溫20-30℃。
c、試劑條只能用鑷子夾取，不能用手接觸。
d、每次試驗(yàn)需設(shè)強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
（四）檢驗(yàn)程度
初篩試驗(yàn)每一次檢測(cè)陰性者可報(bào)告陰性，若第一次檢測(cè)陽(yáng)性，則需進(jìn)行復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)時(shí)（最好用不同類(lèi)型的試劑）可同時(shí)測(cè)定兩孔，判定方法如下：
第一次檢測(cè)第2次檢測(cè)結(jié)果判定
（-）陰性
（+）（-）（-）陰性
（+）（+）（-）/（+）陽(yáng)性
初篩陽(yáng)性的標(biāo)本不能發(fā)報(bào)告，必須將血樣或血袋送本省（本市）艾滋病監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步做確證試驗(yàn)。確證試驗(yàn)陽(yáng)性者，由省（市）監(jiān)測(cè)中心給送檢單位發(fā)出抗-HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃陽(yáng)性報(bào)告，同時(shí)上報(bào)衛(wèi)生廳（局）和衛(wèi)生部疾病控制司備案。確認(rèn)試驗(yàn)陽(yáng)性和可疑的血袋均需送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室妥善處理，絕對(duì)不能發(fā)出使用。

三、PCR在HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃?rùn)z測(cè)中的應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PolymeraseChainReaction,PCR)又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種的短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增特定DNA片段的新技術(shù)。應(yīng)用該方法，可很容易地查到原先那些由于DNA拷貝數(shù)少而不足以檢測(cè)出來(lái)的病毒DNA或其它致病基因，從而大大地推動(dòng)了疾病的DNA診斷和分子克隆基因組DNA工作的發(fā)展。由于該項(xiàng)技術(shù)可將極微量的DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍，甚至能檢測(cè)到單分子或每10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中僅含1個(gè)DNA分子的樣品。它是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法，其特性是由兩個(gè)人工合成的引物序列決定的。所謂引物就是與待擴(kuò)增DNA片段兩翼互補(bǔ)的寡核苷酸，其本質(zhì)是ssDNA片段。

待擴(kuò)增DNA模板加熱變性后，兩引物分別與兩條DNA的兩翼序列特異復(fù)性。此時(shí)，兩引物的3’端相對(duì)，5’端相背。在合適條件下，由TaqDNA聚合酶催化引物介導(dǎo)的DNA合成，即引物的延伸。這種實(shí)驗(yàn)過(guò)程是在溫度控制下進(jìn)行的，一個(gè)變性--復(fù)性--延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)。PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)；延伸的產(chǎn)物經(jīng)第二循環(huán)變性，亦與引物互補(bǔ)，作為引物引導(dǎo)DNA合成的新模板；因此，第二循環(huán)后延伸的模板由第一循環(huán)的4條增為8條，依此類(lèi)推，以后每一個(gè)循環(huán)后的模板均比前一個(gè)循環(huán)增加1倍。理論上講PCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡(jiǎn)便、對(duì)起始材料質(zhì)量要求低等特點(diǎn)。

PCR用于檢測(cè)HIV的優(yōu)點(diǎn)如下：1.與傳統(tǒng)檢測(cè)抗體的方法相比，其靈敏度和特異性更高，從而對(duì)HIV的定量檢測(cè)提供了有效的手段；2.不依賴(lài)于宿主的免疫反應(yīng)，無(wú)須等到免疫系統(tǒng)對(duì)HIV產(chǎn)生抗體后才能檢定宿主受HIV感染的狀態(tài)，這有利于對(duì)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)以前標(biāo)本的檢測(cè)和對(duì)陽(yáng)性母親所生嬰兒的HIV感染的調(diào)查；3.對(duì)潛伏狀態(tài)的HIV的檢測(cè)不依賴(lài)于HIV在宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。

綜上所述，PCR是對(duì)HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃核酸檢測(cè)的有效手段，是對(duì)HIV病毒分離、血清學(xué)抗體檢測(cè)方法的必要補(bǔ)充。在HIV感染的確診和艾滋病診斷中，核酸的檢測(cè)對(duì)病原活動(dòng)的監(jiān)控更加有效方便，因?yàn)楹怂釓?fù)制的有無(wú)和數(shù)量是體內(nèi)病毒復(fù)制情況的直接反映。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)主要用于檢測(cè)血漿中HIV的RNA含量，目前主要用于預(yù)測(cè)母親將HIV傳染給胎兒的可能性以及新生兒的HIV感染狀況。此外，尚可用于判斷病人的預(yù)后及監(jiān)測(cè)抗病毒治療的效果。

四、艾滋病病原學(xué)診斷中的幾個(gè)問(wèn)題。

1、明確不同實(shí)驗(yàn)方法的意義和適應(yīng)范圍：HIV血清學(xué)檢測(cè)分為初篩和確證兩類(lèi)。初篩實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)再次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若仍為陽(yáng)性，則應(yīng)用確證實(shí)驗(yàn)去證實(shí)，只有確證實(shí)驗(yàn)是陽(yáng)性的標(biāo)本方可報(bào)告為HIV抗體陽(yáng)性。另外，能引起艾滋病的病毒分為兩型，即HIV-1和HIV-2，兩型病毒間只有少部分抗原有交叉（主要是Gag基因編碼的核蛋白）。因而各型病毒試劑只能有效地檢測(cè)出同型病毒的抗體。

2、針對(duì)HIV感染不同時(shí)期選用不同的檢測(cè)手段。HIV原發(fā)感染后的兩周內(nèi)，用任何方法均無(wú)法查到病毒的存在，2周后出現(xiàn)病毒血癥，此時(shí)可用抗原檢測(cè)方法、檢查病毒抗原或測(cè)定病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性，而不能用血清學(xué)方法，因?yàn)榭贵w要到感染后6-8周才會(huì)出現(xiàn)。此后就只能用抗體檢測(cè)方法，直到艾滋病的出現(xiàn)，因?yàn)樵谶@段時(shí)間HIV抗原很難從血清中查到，待發(fā)展到艾滋病階段時(shí)才會(huì)重新出現(xiàn)。

3、HIV抗體測(cè)定的靈敏度、特異度和預(yù)測(cè)值：

表1HIV抗體測(cè)定的靈敏度、特異度和預(yù)測(cè)值

檢驗(yàn)結(jié)果	抗體情況		總計(jì)
陽(yáng)性	有 真的 陽(yáng)性（a）	無(wú) 假的 陽(yáng)性(b)	所有陽(yáng)性 試驗(yàn)（a+b）
陰性	假的 陰性(c) 都有抗體	真的 陰性（d） 都無(wú)抗體	所有陰性 試驗(yàn)（c+d） 總計(jì)
	（a+c）	(b+d)	(a+b+c+d)

敏感性：是指在有抗體存在的標(biāo)本中，檢出抗體的準(zhǔn)確性。敏感性低的試驗(yàn)將有許多假陰性。
敏感性=a/a+c
特異性：是指在沒(méi)有抗體存在的標(biāo)本中，檢測(cè)其抗體缺失的準(zhǔn)確性。特異度低的試驗(yàn)將有許多假陽(yáng)性。

特異性=d/b+d
理想的是，一種試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)具有100%的敏感性和100%的特異性。但實(shí)際上，沒(méi)有一種生物試驗(yàn)?zāi)軡M(mǎn)足這樣的要求。但在敏感性和特異性最高的試驗(yàn)方法當(dāng)中現(xiàn)行的HIV檢測(cè)方法還是可取的，在理想的實(shí)驗(yàn)室條件下，許多市售的HIV抗體試驗(yàn)方法的敏感性和特異性都在99%以上。除非由于檢驗(yàn)人員造成人為誤差，這種檢驗(yàn)方法所固有的特性是不會(huì)出現(xiàn)明顯改變的。

陽(yáng)性試驗(yàn)預(yù)測(cè)值（PPV）a/a+b
陰性試驗(yàn)預(yù)測(cè)值（NPV）d/c+d
試劑的敏感性和特異性可以衡量它的優(yōu)劣，但并不能決定一個(gè)測(cè)定結(jié)果正確與否的可能性大小，后者是由測(cè)定的預(yù)測(cè)值決定的。一個(gè)測(cè)定的陽(yáng)性或陰性預(yù)測(cè)值，即這個(gè)陽(yáng)性或陰性的結(jié)果是真陽(yáng)性或真陰性的可能性。這除與所用試劑的優(yōu)劣有關(guān)外，還取決于測(cè)定對(duì)象本身患病率的高低。如表2所示，一個(gè)陽(yáng)性HIV血清檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性，對(duì)舊金山同性戀人群可高達(dá)99.88%，而對(duì)正常人則為18.94%，反之，一個(gè)陰性結(jié)果的真實(shí)性對(duì)前者不足90%，而對(duì)后者則高達(dá)99.997%。

表2ELISA法HIV-1抗體測(cè)定的預(yù)測(cè)值

人群		預(yù)測(cè)值
		陽(yáng)性		陰性
舊金山同性戀人群		99.88		89.06
美國(guó)非高危人群		18.94		99.997

因而我們?cè)趯?shí)際檢測(cè)工作中，對(duì)我國(guó)普通公民初篩試驗(yàn)結(jié)果陰性的預(yù)測(cè)值是非常高的,即可初步排除HIV感染的可能性，而出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，則必需慎之又慎，要嚴(yán)格經(jīng)蛋白印跡等確定實(shí)驗(yàn)證實(shí)后方可報(bào)告。相反，對(duì)來(lái)自疫區(qū)的外國(guó)人或在疫區(qū)長(zhǎng)期居住的歸國(guó)人員可疑陰性結(jié)果，則不能輕易放過(guò)，以免因漏診而造成嚴(yán)重的后果。

4、HIV抗體檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度與HIV感染的概率

許多HIV抗體檢測(cè)方法除了是一種定性實(shí)驗(yàn)外，還同時(shí)是一種半定量實(shí)驗(yàn)。這可表現(xiàn)于測(cè)定不同稀釋度的血清的反應(yīng)性，得出陽(yáng)性血清的最高稀釋度，而ELISA方法則可根據(jù)光密度（0D）值的強(qiáng)度直接確定。反應(yīng)性越強(qiáng)的血清，含有HIV抗體的可能性也就越大。例如，表3中的HIV感染率為30/10萬(wàn)的正常獻(xiàn)血員，中等強(qiáng)度反應(yīng)時(shí)，HIV抗體陽(yáng)性概率僅為1.13%，而在高強(qiáng)度反應(yīng)時(shí)該概率則激增到86.1%，與同樣強(qiáng)度的來(lái)自HIV感染率極高的吸毒人群（45000/10萬(wàn)）的概率相近。

表3HIV感染機(jī)率與ELISA反應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)系

人群HIV感染率ELISA反應(yīng)強(qiáng)度(%)

(/10萬(wàn))低度中度高度 非高危獻(xiàn)血員300.00071.1386.1 高危獻(xiàn)血950.00223.4895.2 軍人1500.00365.3996.9 吸毒者450001.9196.699.9

注：（1）數(shù)字表示相應(yīng)強(qiáng)度反應(yīng)的血清中含有HIV抗體的概率（%）；
（2）低度為OD<1，中度為1，高度為OD>6。

5、檢測(cè)結(jié)果的處理，如果在HIV檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性結(jié)果，一方面應(yīng)立即按國(guó)家法定乙類(lèi)傳染病上報(bào)程序迅速上報(bào)。對(duì)已成年患者應(yīng)通知本人，并向其說(shuō)明陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的意義以及HIV感染與艾滋病之間的關(guān)系，同時(shí)還要忠告他（她）有義務(wù)不從事可將病毒傳給他的活動(dòng)。另一方面，檢測(cè)單位也有責(zé)任為患者保密，以使其在原來(lái)的環(huán)境中生活下去。這不僅僅是出于對(duì)患者的人道，避免因無(wú)知而產(chǎn)生的歧視，同時(shí)也是有效控制艾滋病蔓延的重要保證。可以想象，如果艾滋病病人或HIV感染者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就被趕出單位、學(xué)校、家庭，還會(huì)有誰(shuí)再來(lái)做檢側(cè)。這樣勢(shì)必會(huì)使攜帶HIV的人潛伏于社會(huì)無(wú)法被發(fā)現(xiàn)，艾滋病將傳播得更快、更廣。

此文關(guān)鍵字：實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃,實(shí)驗(yàn)室建設(shè),實(shí)驗(yàn)室裝修,實(shí)驗(yàn)室家具,實(shí)驗(yàn)室維保,實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)系統(tǒng)改造